代谢组学应用新策略

随着组学技术的快速发展，个体化医疗成为国际医学健康领域的重要概念。生物样本作为生命科学研究的基础，其重要性不言而喻。进行代谢组学研究的第一步就是收集好合格的样品，特别对于临床样本的复杂性，我们要制定严格取样标准。如患者是否具有发病史，是否服用非类固醇类抗炎性药物，是否抽烟，是否具有和研究对象不相关的其他疾病或并发症等。另外，临床样本最宝贵是其临床信息，故血生化，肾功能等都将作为研究的重要数据及参考依据。
进行代谢组学研究的第二步是样本的储存，样本的收集往往不是一蹴而就，故而收集的样品需要放在液氮或者-80℃冰箱中长期保存。随着“十二五”国家科技计划的推进，我国生物样本库建设也得到长足的发展。

第三步是样本输运，同样我们要保证样本是在低温条件下抵达实验室的，长距离的运输使用干冰不失为一个很好的选择。为节省经费及人力，实现研究开发的专业化和资源的最优化配置，委托合同研究机构（Contract Research Organization，简称CRO）开展专业的技术开发和研究试验已成为全球研究开发专业化的趋势。

第四步样本提取，第五步上机检测，第六步谱图处理，第七步统计分析，第八步通路解释都可以交给我们这样专业外包服务公司进行。这样，研究人员可以将主要精力放在课题生物学意义的探讨上。

代谢组学实验设计：
实验设计是研究课题的开端，一个良好的实验设计是决定您的研究走向成功的关键。随着代谢组学技术的蓬勃发展，我们总结出代谢组学实验设计的普遍规律如下，注意这不是一个硬性的标准：

样品收集要求及步骤：
不同的生物样本，取样方法不一样，我们遵循以下原则：
1. 微生物和细胞样本：迅速钝化代谢活动（淬灭），如研究胞外代谢，需保持细胞不裂解；
2. 动物体液（如尿、血、组织、器官、唾液）：采样后要迅速预处理，如加入抗凝血剂、防腐剂，并立即冷冻处理          （-80 ℃）；
3.  植物样本：采集后迅速冷冻（液氮），然后转入-80 ℃保存。

下面我们以血液和尿液样本为例，详细说明一下收集步骤：

血清样本制备：
1.   收集步骤血液收集在离心管中静置30分钟进行凝固分层。然后低速离心取上清装载干净的离心管中，再高速离心5分  钟，取上清分装到冻存管中，每管0.5ml，-80度冻存寄送。
2.   样本量要求NMR实验500ul/sample；GC-MS，LC-MS实验200ul/sample；一定避免反复冻融。
3.   注意事项  1）取血时如用酒精消毒，请擦干擦拭部位，待酒精完全挥发后再取样；
2）取血时如用麻醉剂，建议用异氟醚，防止在NMR血清谱图中出现干扰峰；
3）如要采用血浆，请务必使用肝素钠抗凝管。

尿液样本制备：
1.   收集步骤晨起中段尿（临床）或晨间1小时尿（动物）直接分装到离心管中，每管1ml，添加一滴（约10ul）质量体积为1/100（w/v）的叠氮化钠，-80度冻存寄送。
2.   样本量要求1ml/sample；一定避免反复冻融。
3.   注意事项1）动物1小时尿量不够，可分多次收集，不建议一次性收取24小时尿液。
                       2）叠氮化钠的作用是防腐杀菌，有毒，请万分小心。

数据处理方法：
1.     图谱预处理（以NMR谱图为例）：
对谱图进行了傅立叶变换，相位调整，基线校正，定标，及谱峰归属等处理。

 

2.     主成分分析（PCA）：
使用软件对归一化后的数据进行模式识别多变量分析。

3.     偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）
使用软件对归一化后的数据进行偏最小二乘法(PLS)发现数据(X变量)和其它变量(Y变量，分组信息)之间的相关关系。     然后，通过排列实验随机多次(n=200)改变分类变量Y的排列顺序得到相应不同的随机Q2值对模型有效性做进一步的检验。

4.     正交矫正偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）
对PLS-DA模型进行正交矫正处理(OPLS-DA)，最大化地凸显模型内部不同组别之间的差异。同时用载荷图（loading plot，以NMR载荷图为例）展现差异（有显著贡献）的化合物。

5.     差异化合物代谢通路（Pathway）分析
将差异化合物向KEGG数据库映射，获得代谢物的通路分类结果，以TCA CYCLE为例（红色标记的圆点是差异化合物）：

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