文献分享 | 比较全扫描、DDA、DIA 三种采集模式在非靶向代谢组学的差异

非靶向代谢组学正在成为一种强大而有吸引力的技术，已被广泛应用于许多研究领域，全扫描（full-scan）、数据依赖采集 (DDA) 和数据非依赖采集 (DIA) 是基于高分辨质谱的非靶向代谢组学中的三种常见数据采集模式。全扫描是将代谢物一级和二级分开扫描、所需检测时间较长。DDA 中，质谱仪器进行全扫描，然后对从全扫描质谱中选择的母离子（强度依赖）列表进行二级扫描。而理论上，DIA 能够对所有代谢物的 MS2 信息进行连续和无偏倚的采集。但由于其 MS2 质谱信息十分复杂，母离子和子离子关联不紧密，数据处理存在困难。
 

由于每种数据采集模式的独特性和局限性，所以我们有理由相信数据采集模式的选择可能会影响代谢组学结果的质量。作者使用标准品混合物和人尿分别在 RP (+) 和 HILIC (-) 中进行实验。实验结果表明全扫描模式能够获得最多的 peak，其次是 DIA 和 DDA。比较 DIA 和 DDA 中的 MS2 谱图，DDA 中的 MS2 谱图的质量更高，DIA 中 MS2 谱图的数量更多。此外，相对标准偏差结果显示，DDA 在定量准确度上缺点不明显，三种采集模式具有一致性。就数据预处理的便利性而言，DDA 是三种方法中最方便的，它可以从 peak 提取到代谢物的鉴定实现完全自动化，并将基于全扫描的工作流程从天缩短到小时。在处理 DIA 数据时仍需要解决一些生物信息学问题，并且迫切需要开发更有效的计算程序。

 

结果

图1.比较非靶向代谢组学中全扫描，DDA 和 DIA 模式的示意图工作流程
 

全扫描（full-scan）、DDA 和 DIA 综合评估的工作流程示意图如图 1 所示。在这项研究中，研究人员测试了 134 种标准品混合物（StdMix）和 1 份尿液样本（Urine）(原始浓度和 100 倍稀释)。LC-MS 分析在 RP (+) 和 HILIC (-) 中进行，收集数据后，对三种数据采集方式进行 peak 数量、定量精度、MS2 质谱的数量和质量以及便利性等五方面进行比较。

表1.通过三种数据采集方法分析的标准混合物中确认的代谢物数量

* StdMix（L）中检测到的代谢物与 StdMix（H）中检测到的代谢物及相应百分比
 

首先研究人员人工核查标准品的保留时间、准确分子量和 MS2 谱图后，从表 1 的结果中显示，在 RP (+) 和 HILIC (-) 模式下，原始标准混合物（StdMix（H））在全扫描和 DIA 中确认的代谢物数量始终比 DDA 中略高。为了评估不同数据采集模式检测低丰度代谢物的能力，研究人员使用稀释的标准混合物（StdMix（L））进行了重复分析。研究人员在 RP (+) 和 HILIC (-) 分析中，发现与预期的一样，StdMix（L）检测到的代谢物数量比 StdMix (H) 显著减少。与 StdMix (H) 结果相比，全扫描同样检测到了最多的代谢物数量，但 DDA 在被识别的代谢物数量中下降最大，在检测低丰度代谢物方面 DDA 不如全扫描和 DIA 灵敏。

接下来、研究人员进一步在全扫描、DDA 和 DIA 模式下对人类尿液样本进行非靶向分析。使用 MS-DIAL 软件对尿液样本中的 peak 提取、比对数据和代谢产物初步鉴定。数据处理参数手动优化，以达到最佳 peak 提取性能。
 

图 2. 在（A）RP（+），（B）HILIC（-）分析中通过三种采集方法分析的尿液样品中检测到的总 peak 数量、MS1 注释和 MS2 匹配的 peak 数量。
 

研究人员为了评估三种数据采集模式的分析差异，计算了检测到的 MS1 注释和 MS2 匹配的 peak 的总数 (图 2)。在 RP (+) 和 HILIC (-) 分析中，无论尿液样本浓度如何，全扫描和 DIA 模式比 DDA 模式能够覆盖更多的 peak。

图 3.（A）RP（+），（B）HILIC（-）分析中的 peakMS 信号强度的 RSD 分布。
 

除了检测到的 peak 的数量，研究人员还对尿液样本进行了技术重复（一式三份）。经 MS-DIAL 峰校准后，计算 peak 强度的相对标准偏差 (RSD)。如图 3 所示，三种采集模式结果中大于 80% 的 peak 的 RSD 均小于 20%，且在全扫描和 DIA 中准确度佳 (RSD < 5%)。这一趋势在不同浓度尿液样本分析中结果是一致的。DDA 始终具有最小的 peak 百分比（RSD < 5%），且与样品类型、浓度、电离极性或色谱方法无关。说明 DDA 的定量准确度略低于全扫描和 DIA。

图4.（A）RP（+）（B）HILIC（-）分析尿液样品中 DDA 和 DIA 检测到的 MS2 重叠特征

利用人类尿液样本，研究人员比较了 DDA 和 DIA 模式下产生的 MS2 质谱的数量和质量。在 Urine (H)-RP (+),Urine (H)-HILIC (-), Urine (L)-RP (+), Urine (L)-HILIC (-) 分析中，DDA 模式下平均有 43% 的 peak 具有相应的 MS2 谱图。DIA 分析中 100％的 peak 具有相应的 MS2 质谱图。此外，DDA 和 DIA 结果中的具有 MS2 质谱的共同 peak 以 Venn 图显示（图 4）。如图所示，DIA 比 DDA 能够生成更多的 MS2 质谱图。但是，研究人员发现 DDA 可以生成一些 DIA 中没有找到的峰形较差、丰度较低的 MS2 谱图。