小白必看2 | 常见蛋白质组学技术流程汇编

非靶向蛋白质组学

 

1. iTRAQ/TMT 标记定量蛋白质组学

iTRAQ 和 TMT 技术采用多种同位素标记，可与氨基反应实现连接，实现多个样本蛋白组的定性与定量。
 

技术流程：

寄样要求：

动物及临床组织标本 100 mg/sample

血清、血浆 200 µL/sample

细胞、微生物 1ｘ107 cells/sample

植物嫩叶、嫩芽 500 mg/sample

植物种子、果实 100 mg/sample

液氮或者 -80℃ 保存

足量干冰运输，避免反复冻融

 

试剂盒种类：

技术优点：

适用范围广、高通量、结果可靠

灵敏度高

分离能力强

自动化程度高

 

2. Label Free 非标记定量蛋白质组学

Label Free 技术不依赖同位素标记，可通过液质联用对蛋白质酶解肽段进行分析，分析大规模鉴定蛋白质时所产生的质谱数据，对被检测到的离子峰强度进行积分，以积分面积进行相对定量。

 

技术流程：

技术优点：

无需标记，最da程度的保留样本的真实性

可以区分“有”、“无”蛋白

不受标签数量的限制，多个样本可以同时进行蛋白定量分析

不同物种和不同的样本类型可以同时开展蛋白定量分析

处理步骤简单，成本低

 

技术缺点：

低通量

定量准确度有限

对质谱的稳定性和重现性有很高的要求

 

3. DIA 定量蛋白质组学

数据非依赖性采集(DIA)是一种显著提升蛋白质组学研究通量和可重复性的技术。

 

经典的 DIA 流程通常依赖于 DDA 谱图库的构建，需要消耗大量的样品，且周期长，成本高。

 

越来越多的不依赖于 DDA 建库的分析方法相继诞生，例如 DIA-Umpire、PECAN 和 encyclope DIA 等。encyclope DIA 系列技术采用气态在线分离（GPF）。

 

GPF-DIA 技术流程：

常规 DIA 流程：

技术优点：

采集所有离子及碎片图谱，重现性好

基于碎片离子定量，选择性好，可媲美 SPM/MRM

循环时间固定，扫描点数均匀，定量准确度高

高通量，能同时监测所有目标蛋白

 

4. 定性鉴定蛋白质组学

利用液相色谱质谱联用技术（LC-MS/MS）结合数据库检索的方法，对样本中的混合蛋白进行定性鉴定分析。

 

技术流程：

寄样要求：

• 胶条样本

考马斯亮蓝染色 SDS-PAGE 凝胶，条带清晰可见

条带切取操作过程中佩戴手套，防止角蛋白污染

条带置于 EP 管中，-20℃ 保存，冰袋运输

 

• 蛋白溶液

需要提供缓冲液体系以及蛋白浓度数据

蛋白溶液样本中不要加入 loading buffer

液氮或 -80℃ 保存

足量干冰运输，避免反复冻融

 

5. 多肽组学

多肽组学是以机体内源性多肽和低分子量蛋白质为研究对象，研究多肽组的结构、功能、变化规律及其相关关系。

 

技术流程：

技术优点：

高效

高通量

高特异性

破坏度小

高灵敏度

靶向蛋白质组学

（PRM 靶向定量蛋白组）

平行反应监测（PRM）是一种靶向检测方法，能够对目标蛋白、目标肽段进行选择性检测，从而实现对目标蛋白/肽段进行相对（绝对）定量。

技术流程：

技术优点：

不依赖抗体

特异性

结果准确、可靠

高通量

 

修饰蛋白质组学

利用 LC-MS/MS 结合数据库检索的方法，在搜库时设置修饰搜库参数，实现对目标所有已知的修饰位点磷酸化、乙酰化、糖基化和泛素化进行鉴定。

技术流程：

 

蛋白代谢互作组

代谢物-蛋白质相互作用控制着多种细胞过程，从而在维持细胞稳态中发挥重要作用。MetPro 技术是一种化学蛋白质组学方法，将蛋白质水解（Lip）和质谱（MS）结合起来。用于进行代谢物-蛋白质相互作用的研究，筛选与代谢物具有相互作用的蛋白质。

技术流程：

 

蛋白组生信分析

1. 基础分析

数据预处理

差异表达蛋白筛选

 

2. 常规数据分析

主成分分析


火山图分析


层次聚类分析
 

3.功能分析
 

COG 注释分析


亚细胞定位分析


GO 注释富集分析


KEGG 注释富集分析


PPI 网络构建分析
 

4.修饰蛋白特有分析
 

Motif 分析


激酶（kinase）预测分析