高分≠高经费 | 仅单一蛋白组+小鼠样本+36例，也可发29分SCI !!!

心血管疾病，尤其是冠状动脉、颈动脉或外周动脉的动脉粥样硬化，是血管中的潜伏杀手，随时威胁着人类的生命。血流恢复通常需要介入治疗，包括冠状动脉、颈动脉或外周动脉的球囊血管成形术和支架植入术。此类手术经常导致内皮下瘢痕的形成，称为新生内膜。新内膜形成本身可能成为一种严重的疾病，受治疗冠脉局部损伤后“愈合”反应而造成局部血管腔的再次狭窄。再狭窄的发生率在6%-40%之间，因此成为动脉粥样硬化病变介入治疗的限制因素。重要的是，再狭窄也会影响预后：与没有再狭窄的患者相比，再狭窄患者的死亡率更高。因此，找到预防新生内膜形成的治疗策略具有重要的临床意义。

 

2021年心血管领域顶.级期刊European Heart Journal（IF=29.983）杂志在线发表了德国普朗克生物化学研究所、德国慕尼黑工业大学慕尼黑德国心脏中心、德国鲁贝克大学心脏遗传学研究所等多个研究机构的题为“A proteomic atlas of the neointima identifies novel druggable targets for preventive therapy”的研究性论文，研究新生内膜形成的蛋白质组图谱，并确定TRPC6可作为新的治疗和预防靶点，抑制TRPC6可能是预防血管损伤和支架植入术后新生内膜形成的一种有效策略。

 

 

 

01.研究方案和假设

 

TRPC6抑制通过阻断平滑肌细胞的迁移和增殖，为抑制新生内膜的形成提供了一种补充策略（图1）。

图1. 研究方案与假设

 

02.实验样本小鼠股动脉

 

03.实验分组

• 对照组—sham control：3d、7d、14d（与损伤组取样时间一致对照，n=6）
• 钢丝损伤组—wire injury：3d、7d、14d（损伤3天、7天、14天后，n=6）

 

04.实验技术

Label free蛋白组

 

05.样本总计

 

实验结果

 

一、小鼠血管损伤后血管蛋白质组的变化

 

血管损伤导致血管的实质性组织重塑，并最终导致新内膜的形成。为了在蛋白质组学水平上研究这一过程，作者通过线划小鼠左股动脉（n=6）诱发血管损伤，并在3到14天后取出血管。经蛋白组学检测定量到三个不同时间点的4836种蛋白质。所有条件下的平均变异系数（CV）<2%表明再现性非常高（图1B）。值得注意的是，钢丝划伤的股动脉在任何时间点都比未受伤的动脉多出约700–1100个量化蛋白质，平均每根受伤的血管有4286个蛋白质，而未受伤的有3349个蛋白质（图2C）。主成分分析显示，在第一个成分中，未受伤和受伤的单动脉明显分离（图2D）。2918种蛋白质的表达水平表现出统计学上的显著变化（FDR<0.01，s0=1）（图2E）。

图2. 新生内膜形成的蛋白质组学分析

 

为了更好地理解新内膜形成的过程，作者接下来在每个时间点对受伤和未受伤的血管进行两两比较，并对显著调节的蛋白质进行通路分析（图3A、3B）。血管损伤反应上调的蛋白质主要参与免疫反应、细胞粘附、细胞激活、细胞外基质（ECM）、增殖和迁移相关的途径。值得注意的是，在血管损伤后第7天，从GO类目“先天免疫应答”中鉴定出的所有蛋白质中，超过70%的蛋白质被显著上调（图3C）。与凝血、细胞增殖和细胞迁移相关的蛋白质在第3天表现出最大的差异性调节，表明损伤后早期特异性通路激活。

图3.每个时间节点调节蛋白的通路分析

 

二、血管损伤对小鼠核心基质及基质相关成分的影响

 

为了跟踪ECM重塑过程，作者选择了所有与先前定义的核心基质蛋白列表重叠的显著调节蛋白。层粘连蛋白是基底膜的主要成分，介导细胞分化、迁移和粘附等重要功能。六种层粘连蛋白中有五种从第3天开始下调（Lama2、-a4、-a5、-b2和-c1），第7天下调约两倍，第14天效应大小不变（图4）。只有Lamb1表现出不同的行为，在第14天时有两倍的上调（P<0.00004）。因此，除了受损血管中层粘连蛋白的总体减少外，层粘连蛋白亚单位组成也发生了变化，含有层粘连蛋白的Lamb1相对于含有层粘连蛋白的Lamb2在钢丝损伤后增加了四倍。表明血管损伤对小鼠基质相关成分的影响。

图4. 血管损伤后细胞外基质重塑的时间分辨分析

 

三、小鼠新生内膜形成过程中迁移因子的调节

 

主动脉平滑肌细胞的迁移是新生内膜形成的一个标志，因此，作者重点关注在细胞迁移中具有调节功能的蛋白质（图5A和B）。比较损伤后第3天和第14天蛋白质的显著变化，观察到与对照组血管相比，大量迁移因子持续上调（例如Ptprc、Myo1g）。相反，也在早期（如Itga2b、Spp1）或晚期（如Itga11、Fadd）时间点明确上调的确定因素（图5B）。其他显著的表面标记物包括Cd34、Cd44和Cd47（图5C），这些标记物在损伤后改变其表达。Cd34是血管内皮细胞的一种标记物，已知其能够阻止细胞粘附过程，尤其是肥大细胞。

图5. 新生内膜形成过程中参与细胞迁移的蛋白质的调节

 

四、Trpc6促进小鼠新生内膜的形成

 

作者深入挖掘数据，寻找可能用于药理应用的新靶点。发现一种蛋白符合以下五个预先规定的标准：（i）血管损伤后表达增加；（ii）早期瞬时表达水平最高；（iii）在非损伤组织中低表达或不可检测；（iv）先前与细胞迁移的关联；（v）可用的药理抑制剂。这种蛋白质是典型的Trpc6，是一种非选择性阳离子通道，功能于内皮细胞和动脉SMCs的质膜。为了测试Trpc6是否参与体内新生内膜的形成，作者在Trpc6-/-和野生型小鼠（n=7）中进行了损伤，并在28天后分析了新生内膜的形成（图6A）。与野生型小鼠相比，Trpc6-/小鼠的新生内膜面积减少（图6B），新生内膜-中膜比率也显著降低（图6D）。这些结果为Trpc6在小鼠新内膜形成中的作用提供了证据。

图6. Trpc6-/-小鼠的新生内膜形成

 

五、Trpc6可作为治疗新靶点

 

为了研究Trpc6对平滑肌细胞的影响，作者分析了人主动脉血管平滑肌细胞（SMC）在体外的迁移和增殖。与对照组相比，TRPC6激活剂OAG在8和12小时后导致体外伤口重合度增加（图7A）。OAG还增强了人主动脉平滑肌细胞的增殖（图7B）。相反，TRPC6抑制剂SAR7334在12小时后减少了血管SMC的迁移（图7C）。

图7. TRPC6是血管重塑的新靶点

 

本文研究了健康和受损动脉壁的蛋白质组图谱，发现TRPC6是一个新的治疗和预防靶点，具有防止血管损伤和支架植入术后继发的新生内膜形成的重要作用。

 

文献下载链接：

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