百趣代谢组学资讯：机制探索不发愁，浅看真菌防治靶点代谢组学研究思路

文章标题：Energy metabolism as the target of 3-phenyllactic acid against Rhizopus oryzae

发表期刊：International Journal of Food Microbiology
影响因子：5.277
合作客户：兰州理工大学
百趣生物提供服务：TMT+中心碳
分组：2mg/mLPLA治疗组、4mg/mLPLA治疗组、8mg/mLPLA治疗组和对照组(n=3)
研究背景
3-苯乳酸(PLA)具有广泛的抗真菌活性，但对PLA在真菌细胞上的作用靶点及其作用机制的研究较少。本研究探讨了3-苯乳酸对引起腐烂百合鳞茎的米根霉菌(R.oryzae)的抑制作用。PLA对米根霉菌的最低抑菌浓度为8mg/mL。通过扫描电镜和透射电镜观察米根霉菌的超微结构，结果表明PLA对米根霉菌的细胞膜没有损伤，但对线粒体和其他细胞器有破坏作用。TMT蛋白组分析结果显示PLA显著下调己糖激酶(HK)、磷酸果糖激酶(PFK)、a-酮戊二酸脱氢酶(a-KGDH)、腺苷酸激酶(ADK1)、细胞色素C氧化酶(Cytochrome C oxidase)和NADH脱氢酶(NADH dehydrogenase)的表达(P<0.05)。在糖酵解、三羧酸循环或氧化磷酸化代谢过程中，线粒体ADP/ATP载体蛋白(AAC)和亚基IV(CCIO IV)表达上调(P<0.05)。在此基础上，通过酶活性检测发现上述通路HK和a-KGDH活性下调，并通过实时荧光定量PCR进一步证实ADK1、AAC、CCIO IV和NADH脱氢酶基因表达下调。中心碳代谢组学研究表明，三羧酸循环代谢产物中柠檬酸、顺-乌头酸、异柠檬酸、-酮戊二酸、琥珀酸、富马酸和苹果酸均显著下调(P<0.05)，氧化磷酸化产生的ATP也显著减少(P=0.02)。导致能源生产不足。因此，ROS水平升高了141%，细胞色素C被释放，细胞逐渐凋亡。结果表明，能量代谢是PLA对米根霉的作用靶点。这一研究首次表明PLA对米根霉的能量代谢可能是其作用靶点，为进一步研究其抑菌机理提供了理论依据。
研究结果
3-苯乳酸对米根霉生长的抑制作用
PLA处理组(2和4mg/mL)菌体的菌丝干重均低于对照组。当PLA浓度达到8 mg/mL时，随着培养时间的延长，米根霉测得的干重基本没有变化，说明在该浓度下米根霉的生长受到了严重的抑制。实验结果表明，3-苯乳酸对米根霉的生长有较好的抑制作用，且随着3-苯乳酸浓度的增加，对米根霉的抑制作用越明显。


图1. 米根霉的生长曲线(灰色线为对照组，红色线为2mg/mLPLA治疗组，蓝色线为4mg/mLPLA治疗组，绿色线为8mg/mLPLA治疗组)
3-苯乳酸对菌丝形态和超微结构的影响
用扫描电镜(SEM)观察了稻瘟菌的菌丝形态。对照样品形态正常，菌丝饱满，表面光滑(图2.A1和A3)。PLA处理米根霉24h后，我们发现菌丝密集杂乱(图2.A2和A4)，菌丝管肿胀起皱；但表面无明显损伤或缺失(图2.A4)。在菌丝表面观察到一些分泌物(圆圈)，推测为胞外多糖(图2.A4)。因此，推断PLA处理对米根霉细胞壁没有造成严重的破坏。
电镜观察显示，对照组米根霉的超微结构完整，细胞壁正常光滑，细胞膜结构正常，胞浆壁无分离，线粒体形成相对规则(图2.B1-B4)。经3-苯乳酸处理后,整个细胞结构萎缩，细胞外壁变薄，厚度不均匀。内侧细胞膜呈齿状凹陷，局部浆壁分离。细胞核消失，基质和内嵴不可见。细胞膜呈齿状向内，浆壁部分分离(图2.B4中红色箭头)。线粒体固缩，液泡塌陷。
综上所述，PLA对米根霉线粒体及其他细胞器的破坏程度较高，这可能是PLA对米根霉抑制作用的靶点。

图2.对照和PLA处理米根霉的SEM和TEM检查:(A)SEM检查，(B)TEM检查。A1(200×)、A3(1500×)、B1(1500×)、B3(6000×)为对照，A2(200×)、A4(1500×)、B2(1500×)、B4(6000×)为PLA处理。CW代表细胞壁，M代表线粒体，V代表液泡，N代表细胞核，GI代表糖原。
3-苯乳酸的蛋白表达对米根霉菌有抑制作用
利用TMT蛋白质组学方法，在PLA处理组和对照组之间发现了485个差异表达的蛋白。其中，PLA处理组有205个蛋白表达上调，280个蛋白表达下调。对差异表达蛋白进行COG分析(图3)得知PLA可通过控制能量代谢影响米根霉菌的生长。且经PLA处理后的米根霉菌中HK、FK、SDH和a-KGDH的活性受到抑制。相比之下，PLA处理后的米根霉菌中PFK活性略有增加，碳流可能被转移到其他丙酮酸分支点。这些结果与差异蛋白表达是一致的。

图3. 差异表达蛋白的COG分析

图4. 与糖酵解和TCA循环相关的关键酶活性，星号表示样本间差异显著(*P< 0.05;* * P< 0.01;***P < 0.001)
表1. 4mg/mLPLA处理组与对照组在糖酵解、三羧酸循环或氧化磷酸化代谢中蛋白表达有显著差异


米根霉菌中心碳代谢产物的差异及分析
通过中心碳检测，我们在对照组和PLA处理组之间确定了51个中心碳代谢产物，其中22个代谢产物显著上调，29个代谢产物显著下调 (图6)。利用KEGG数据库对差异代谢产物的代谢途径进行分析，差异表达的代谢产物在TCA循环、乙.醛酸和二羧酸代谢、糖酵解或糖异生、丙酮酸代谢、光合生物碳固定和磷酸戊糖途径中显著富集。在本研究中， PLA处理显著降低了米根霉菌中ADP和ATP的水平(表2)，说明PLA处理影响了米根霉菌的能量代谢。机体线粒体中的OXPHOS负责90%以上的细胞ATP的产生，结合蛋白质组学分析，这种效应可能是由于OXPHOS中一种或多种酶活性明显缺乏，导致ATP合成减少。
表2. 4mg/mLPLA处理组与对照组在糖酵解、三羧酸循环或氧化磷酸化代谢中中心碳代谢产物的表达差异显著


图6. 中心碳代谢产物在对照组和PLA处理组之间的差异
3-苯乳酸对细胞色素C释放和ROS水平的影响
经过PLA处理的米根霉菌细胞质中的细胞色素C含量更高(图7A)，这表明位于线粒体内外膜的细胞色素C缺失。在之前的一项研究中，反式肉桂醛处理导致细胞色素C渗漏并触发线粒体介导的细胞凋亡。推断PLA可能导致线粒体呼吸链功能障碍，进而导致ATP缺乏，导致细胞死亡。
当PLA处理米根霉菌，ROS水平增加，在4.0mg/LPLA时，ROS水平增加了141%(图7B)。结果表明，PLA处理诱导水稻植株ROS积累，可能引起线粒体功能障碍和细胞氧化损伤。
在本研究中，我们发现PLA影响糖酵解、TCA循环和氧化磷酸化，导致能量生产不足和细胞凋亡。虽然目前还没有关于对米根霉菌的抑制作用的研究，但与乳酸相比，PLA对其他真菌如黑曲霉具有显著的抑制作用，与乙酸相比，PLA没有明显的刺激性气味。此外，使用乳酸作为催化剂生产PLA可能是一种可行且环保的方法。因此，PLA可以作为一种很有前景的天然机制来控制食品中的污染物。

图7. 对照组和PLA处理组之间的ROS水平和Cyt C释放，星号表示样本之间存在显著差异(*P < 0.05;* * P < 0.01;***P < 0.001)
结论
PLA对真菌细胞靶点的作用及其抗真菌机制研究较少。本研究通过生理生化、电镜、TMT蛋白质组学和中心碳代谢组学等方法，探讨了米根霉菌对百合腐烂球茎的抑制作用。首先，我们证明了PLA抑制了米根霉菌的生长，破坏了米根霉菌的形态和超微结构。其次，我们发现PLA处理降低了与糖酵解和TCA循环相关的关键酶的活性，导致丙酮酸和TCA循环产物的减少和能量的损失。最后，PLA处理通过影响电子传递链中的关键蛋白来影响氧化磷酸化，导致能量生产不足，且使米根霉菌的ROS水平升高，细胞色素C释放，导致细胞凋亡逐渐发生。综上所述，PLA通过能量代谢抑制米根霉菌的生长(图8)。这是首次对PLA抑制真菌的机制进行全面研究。因此，PLA可作为一种有效的天然抗真菌药物。



图8. PLA抑制稻瘟病菌的可能机制是基于能量代谢，紫色代表减少，红色代表增加
文/阿趣代谢组学