百趣代谢组学资讯:植物挥发性有机物生物合成机理及抗菌性研究IF14.46

食品微生物安全性一直是一个备受关注的课题。传统的化学防腐剂在实际应用中仍占主导地位，随着人们对微生物和化学安全食品的需求日益增加，传统的化学防腐剂正逐渐淡出研究者和消费者的视线，因此，天然产物被认为是很有前途的替代品，特别是具有生物相容性、可获取性和实用性的植物挥发性有机化合物(VOCs)，在食源性病原体和腐败生物方面被发现是有效的。

2022年5月13日，Trends in Food Science & Technology（IF=14.46）杂志在线发表了浙江大学罗自生团队发表的题为“Rethinking of botanical volatile organic compounds applied in food preservation: Challenges in acquisition, application, microbial inhibition and stimulation”的综述文章。

本文旨在全面回顾VOCs的生物合成和抗菌机理，从应用研究和基础研究两方面对VOCs在食品病原体防治中的当前和潜在应用进行了总结。系统地描述了VOCs的生物合成和限速步骤，为VOCs产生的合成生物学提供了指导。同时，本文对挥发性有机化合物和精油进行了概念上的区分，其中每种挥发性有机化合物成分的协同作用和拮抗作用需要更多的研究。合成生物学技术可以取代传统的提取技术，实现VOCs的大规模生产，然而，VOC生物合成及调控途径还有待破解。气调包装、乳液、涂料等是VOC应用的多功能平台，是解决影响VOC实际应用挑战的解决方案。由于其潜在的毒性，需要严格的监管和安全评估。
01VOCs的生物合成
根据生物合成途径和化学结构的不同VOCs可以分为挥发性苯丙.烷类化合物(Volatile phenylpropanoids/benzenoids,VPBs)、挥发性萜烯类化合物(volatile terpenoids,VTPs)、挥发性醇醛类化合物(volatile alcohols/aldehydes,VAAs)。VTPs以C5异戊.二烯单元为代表化学结构，这些基本的C5-异戊.二烯构建单元由两个不同的途径产生，即定位于细胞质的MVA途径和定位于质体的MEP途径。异戊.烯基二磷酸(IPP)及其烯丙基异构体二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)是常见的五碳萜类前体，它们是由以乙.酰辅酶A为底物的MEP途径和以丙.酮酸为底物的MVA途径生成的。用于合成挥发性倍半萜(C15)的前体主要由MVA途径提供，而MEP途径提供合成挥发性半萜(C5)、单萜(C10)和二萜(C20)的前体。3-羟基-3-甲基戊.二酰辅酶A还原酶(HMGR)被认为是MVA途径中的限速酶；丙.酮酸和3-磷酸甘油.醛作为MEP通路的底物，是初级代谢产生的代谢物，所以MEP通路受到初级代谢的速度限制。VPBs的生物合成始于必需氨基酸苯丙氨酸(Phe)作为底物。与萜类生物合成类似，初级代谢控制碳(磷酸烯醇丙.酮酸)流入VPBs生物合成，而VPBs合成是由3-deoxy-d-arabino-heptulosonate 7-phosphate (DAHP)合酶(DHAPS)介导的，后者控制莽草酸途径产生苯丙氨酸。与VTPs和VPBs相比，(Z)-3-己烯醇、壬醛和茉莉酸甲酯(MeJA)等VAAs是由分解代谢产生的，多不饱和脂肪酸(PUFAs)如C18不饱和脂肪酸、亚油酸或亚麻酸，是VAAs产生的源头。PUFA的细胞含量取决于丙酮酸产生的乙酰辅酶A质体池，进入脂氧合酶(LOX)途径的部分PUFA通过α-双氧化酶转化为α-hydro(pero)xy PUFAs，其他部分转化为自氧化产物。这些脂质过氧化物衍生物质将通过两个分支途径进一步加工：丙二烯氧合酶(AOS)支路和过氧化氢裂解酶(HPL)支路，最终通过异构化产生多种多样的VAAs。

图1. 植物挥发性有机化合物（包括VTP，VPB和VAAs）的生物合成途径概述
02VOCs抵御病原体的机制对病原细胞的直接细胞毒性
VOC对细菌和真菌膜结构的直接破坏是普遍公认的，这会影响膜的完整性和病原体的通透性。膜的破坏导致离子泄漏，电位降低，质子泵崩溃和ATP生产停止。酚类萜类化合物的羟基已被假定为作为一价阳离子跨膜载体起作用，将H携带到细胞质中并将K转运出去（Ben Arfa等人，2006）。VTPs的结构分化决定了它们的抗菌活性。对不同VTP在控制一系列病原体（包括模型细菌和真菌）方面的比较研究表明，特定结构和游离酚羟基的存在对于抗菌活性至关重要。VPB还能够改变多糖，脂肪酸和磷脂层的构象，从而凝固细胞质并破坏病原体细胞增生膜和细胞膜的功能。此外，发现VPB可以诱导酿酒酵母的细胞死亡，酿酒酵母是一种模式微生物。然而，细菌对VOC的敏感性可能受到pH，蛋白质，脂肪，盐，温度和条件等因素的影响，这些因素在各种食品中大致不同。因此，需要各种方法、治疗方法和适用方式来减少不利影响，这为今后挥发性有机化合物的应用提供了指导。
宿主免疫的调节
挥发性有机化合物是源自植物来源食物的代谢物，在其宿主的多种生物途径中具有多功能功能，包括宿主免疫调节。代谢组学这些发现对于了解VOC如何增强宿主对病原体的抵抗力的潜在机制是必要的，并表明VOC可以成为特别是植物来源食物的预处理方法。为了响应病原体相关分子模式(PAMPs)，如鞭毛蛋白，细胞壁降解酶和病原体分泌的其他毒素，植物来源的宿主进化出一种相对保守的免疫，称为PAMPS触发的免疫(PTI)。同样，针对植物PTI，病原体已经进化出一种III.型分泌系统，该系统提供类似效应的蛋白质以抑制植物PTI信号传导并促进入侵。植物来源的宿主可以识别致病效应器并诱导信号通路，导致效应器触发的免疫(ETI)，这可以触发超敏反应(HR)并最终抑制病原体生长。
参与病原性代谢
一些对致病细胞具有致死性的挥发性有机化合物对宿主细胞也是有毒的。因此，在自然中，许多这些VOC以化学修饰的形式储存，对宿主细胞没有毒性。为了发挥抗菌作用，这些修饰的VOC能够参与致病性代谢，并在病原细胞的修饰去除时进行，致病细胞释放毒性并导致病原体致死。VPB是广泛分布在植物中的防御化学物质，已被证明对昆虫，真菌和细菌有效，缺乏类苯胺生物合成的突变体导致抗病性不足，然而，一些防御类苯胺也对植物细胞有毒。为了避免对宿主细胞的毒性，类苯.甲醚被修饰成葡萄糖基化形式，这对宿主细胞无害。一旦组织被破坏，类苯胺的葡萄糖基化形式将被病原体摄入，并通过β葡萄糖苷酶代谢水解，从而去除葡萄糖基化，在致病细胞中产生有毒的阿葡萄糖酮。这些结果表明，VOCs可以间接参与病原代谢，并通过化学修饰发挥毒性。

图2. 挥发性有机化合物的抗菌机制包括直接破坏、诱导宿主免疫和参与致病性代谢
03挥发性有机化合物在食品病原菌防治中的实际应用及候选
在基础代谢组学生物学研究和应用研究中，挥发性有机化合物的抗菌作用得到了广泛的研究。本摘要基于挥发性有机化合物的效率、机理、剂量和应用方式。我们总结了VTP，VPB和VAAs的不同特征，以进行比较并提出VOC作为抗菌剂的潜在候选者，这些候选药物在食品以外的领域进行了研究。
VTPs在食品保鲜中的应用及潜力
VTPs广泛应用于肉制品的保鲜，肉制品总是富含脂类化合物，易受食源性病原体的污染。VTPs对食源性病原体的有效致死率是将其用于肉制品的好处之一；此外，在储存阶段，脂质化合物的氧化会产生意想不到的味道，许多萜类化合物具有较强的抗氧化能力，能够挽救贮存过程中的异味状况。对于植物性宿主而言，VTPs能够激发植物源寄主的免疫，增强其对微生物的抵抗力，同时可以直接破坏其膜结构，造成直接杀伤，但对非植物源腐殖物寄主病原菌的直接致死能力有限。
VPBs在食品保鲜中的应用及潜力
VPBs对食源性病原体和微生物毒素的产生均具有良好的抗致病菌作用。许多VPBs的MIC低于VTPs和VAAs，这表明VPBs作为一种抗食源性病原体的抗菌药物具有广阔的应用前景。虽然许多VPBs具有强大的抗菌和抗氧化能力，但VPBs使用在肉产品时容易产生不良风味，而乳液等封装技术的结合将是一种解决方案。对于植物源性食品而言，VPBs具有突出的适用性，因为许多VPBs属于植物源性食品的挥发性气味和味道的组成部分。此外，对于一些深加工产品，如奶酪，VPBs可以增强其风味，这表明VPBs可以作为食品添加剂，既增强风味，又解决微生物问题。
VAAs在食品保鲜中的应用及潜力
许多研究普遍证实了VAAs及其衍生物对植物病原菌的直接破坏作用，但在食品领域少被研究，这表明VAA是一种尚未开发的天然抗菌剂。许多VAA因其高挥发性而具有强烈的气味，这可能会影响食品的风味，然而，由于其同源性，它们与植物源性食品相容。对于一些加工过的植物源性食品，如果汁，可以添加VAAs作为一种风味添加剂，同时也具有抗菌作用。虽然醛类是最具抗菌作用的VAA化合物，但由于其氧化性，不适合用于富含脂质的产品。
04挥发性有机化合物在食品微生物控制中的应用挑战：重新思考视角
虽然根据目前的综述，挥发性有机化合物在控制食品病原体方面具有显著的活性，并且作为食品防腐剂具有广阔的应用前景，但在食品工业中的实际应用仍然存在挑战。
对于食品品质的潜在风险
通过代谢组学研究发现，虽然挥发性有机化合物具有良好的生物相容性，但其局限性包括：（1）对感官特性的影响；（2）破坏果蔬产品组织；（3）氧化富含脂类产品中的脂类，这些都是挥发性有机化合物对食品品质的潜在副作用。由于挥发性高，挥发性有机化合物表现出强烈的气味，影响感官特性，但有时有些挥发性有机化合物与所使用的食品是相容的，有些甚至有助于改善味道，因为挥发性有机化合物本来就存在于这些食品中，对其感官性质的影响很小。然而，对于非植物性食品尤其是肌肉类食品和部分植物性食品而言，VOCs对风味的影响为其实际应用设置了障碍，需要进行全面的感官评价。不适当的植物源挥发性有机化合物的浓度或类型往往会对食品造成严重的伤害。封装VOCs可以避免VOCs与食物基质的直接接触，控制其释放，减少其对食物风味的影响。此外，封装挥发性有机化合物可以保护其化学特性，减少其暴露于环境条件和控制其流动性。包封可以通过乳液和涂层/生物膜的结合来完成。乳剂可将挥发性有机化合物封装成液滴，为挥发性有机化合物的长期利用提供了可能的载体。
微生物对VOCs毒性的逃逸机制
病原菌经过无数年的共同进化，形成了应对逆境的反应机制，包括规避VOC的毒性。研究证实，病原菌能够通过外排机制解毒导致细胞毒性的VOCs，此外，一些病原体已经破译了VOCs，并操纵它们招募盟友，一些病原体已经发展出成熟的转化系统，能够将VOCs吸收为自己的养分。体外研究表明，外源萜烯处理可激活真菌中与萜烯相关的一系列基因，研究表明，一类ABC转运蛋白可将多余的单萜泵出细胞，而这一种蛋白广泛存在与各种微生物中。VOCs甚至可被病原菌作为营养源利用，在生长的早期到中期，青霉菌能够将柠檬烯转化为其他无毒的萜类化合物，如α‐松.油醇，这表明青霉菌有可能通过这一途径避开来自柑橘的柠檬烯的攻击。
VOCs在食品工业的安全与管理标准
由于VOCs具有广阔的利用潜力，对其进行风险评估对其未来的应用是必要的。实际上，围绕细胞毒性、代谢毒性和皮肤毒性以及蛋白质加合物、DNA加合物和细胞骨架形态的潜在机制进行的综合研究已经得到了广泛的研究。大多数VOCs的直接毒性仅在非常高的浓度下存在，表明如果严格控制VOCs的应用浓度，则基本安全。应严格考虑的第一个监管方面是浓度。另一个方面是加工和储存毒性：食品总是在高温、高渗压、酸性或碱性条件下加工或储存。高温或其他极端条件可能导致VOC降解，这可能会产生有毒的VOC衍生物。除了加工毒性外，挥发性有机化合物与食品成分之间的相互作用或化学反应也可能产生有毒化合物。因此，应在VOCs的最终应用前进行一系列系统的安全性评估。
VOCs的生产
微波辅助萃取、酶辅助萃取、超临界流体萃取、超声波辅助萃取等绿色技术已被广泛应用于植物源食品副产物的生物活性物质的提取，其中一些技术适用于从植物或植物源性食品及其副产品中提取具有挥发性特征的物质，这些副产品提取物的再利用造就了一种低成本的生物防腐剂技术。其中，超临界流体萃取是萃取挥发性有机化合物的最佳技术，因为在萃取条件下生物活性保持不变。分子生物学和计算机科学的快速发展为“细胞工厂”的建设提供了支持，“细胞工厂”可以大规模生产VOCs。

图3. 转化细胞外单萜烯的ABC转运蛋白保存在微生物中（A），由高水平的d-柠檬烯引起的代表性肝细胞病变（B），挑战，未来前景和潜在的解决方案，用于透视研究和植物VOC的实际利用（C）
植物挥发性有机化合物在控制食源性病原体和腐败生物方面具有多功能性。根据化学结构，挥发性有机化合物分为VTP，VPB和VAAs，分别受到HMGR，DAHP和LOX酶的速率限制。确定了VOCs的初步生物合成途径，使合成生物学研究能够大规模合成VOC。机理研究发现，挥发性有机化合物可直接改变致病细胞膜的功能，损害能量代谢。挥发性有机化合物也能够触发新鲜农产品的SAR。同时，挥发性有机化合物在病原体摄入后可参与或干扰病原性代谢，并产生有害化合物，从而优雅地防止对宿主的毒性。许多挥发性有机化合物在基础研究中作为天然抗菌剂具有很高的潜力，但在应用研究中却被忽视。我们发现不同挥发性有机化合物具有不同的抗菌特性。VTP在控制腐败生物和食源性病原体方面均有效，在保护食源性病原体方面尤其突出，VAAs大多具有未开发的潜力。从未来来看，代谢组学挑战仍然阻碍VOC在食品保鲜中的应用发展。适用挑战涉及:（1）副作用，包括降低感官特性，对植物来源食物的伤害和脂质的氧化；(2)逃避病原体的挥发性有机化合物的毒性或利用挥发性有机化合物作为营养来源；（3）挥发性有机化合物对人体的潜在毒性；（4）通过绿色提取技术和合成生物学获取挥发性有机化合物，可以通过多样化的输送系统和对应用浓度的严格监管来解决。在考虑并解决这些问题后，我们认为植物挥发性有机化合物可以成为食品微生物问题控制的“绿色解决方案”。
文/阿趣代谢组学