J Pineal Res | 骨质疏松症改善新发现！肠道微生物助力调节

 

文章标题：Gut microbially produced tryptophan metabolite melatonin ameliorates osteoporosis via modulating SCFA and TMAO metabolism

发表期刊：Journal of Pineal Research

影响因子：8.3

百趣提供技术服务：氧化三甲*胺、短链脂肪酸靶向代谢组学

文章简介

骨质疏松症(Osteoporosis, OP)是一种以骨质减少和骨骼微结构恶化为特征的慢性代谢性骨骼疾病。褪黑素(Melatonin，MLT)是一种重要的内源性激素，调节骨代谢，维持骨稳态，并改善OP的进展。研究表明，MLT参与调节肠道微生物和肠道屏障功能，但肠道微生物代谢物MLT在OP中的作用仍不清楚。

2024年3月29日，Journal of Pineal Research杂志上发表了题为Gut microbially produced tryptophan metabolite melatonin ameliorates osteoporosis via modulating SCFA and TMAO metabolism的研究论文，揭示了MLT以肠道微生物群依赖的方式重塑肠道TMAO和SCFA代谢减轻炎症和骨量丢失，影响M1/M2巨噬细胞平衡和肠道通透性改善OP小鼠的骨质量丢失，表明肠道微生物产生的MLT通过“肠-骨”轴在OP进展中起着重要作用，这可能为治疗OP的新型药物开发提供新的见解。百趣生物为此研究提供了氧化三甲*胺，短链脂肪酸靶向代谢组学检测服务。

实验结果

1. 肠道微生物群依赖的色氨酸代谢与OP进展密切相关

首先，为了确定肠道微生物依赖的色氨酸代谢是否与OP的进展有关，构建卵巢切除(Ovariectomized, OVX)诱导的小鼠OP模型（图1）。Micro-CT图像显示，OVX小鼠与对照组相比骨质量显著丢失（图2A），主要表现为骨矿物质密度(bone mineral density, BMD)降低、骨体积/组织体积比(bone volume/tissue volume ratio, BV/TV)降低、骨小梁数量(trabecular number, Tb.N)减少、骨小梁厚度(trabecular thickness, Tb.Th)增加以及骨小梁间距(trabecular separation, Tb.Sp)增加（图2B）。接下来，色氨酸靶向代谢组学分析显示两组之间有明显差异（图2C）。热图结果显示，29种与色氨酸相关的代谢物，包括血清素通路、吲哚乙*胺通路和芳香烃受体通路中的代谢物（图2D），其中有5种代谢物有显著差异，包括3-羟基***** (3-Hydroxyanthranilic acid, 3-HAA)、色胺、色醇、3β-吲哚丙稀酸和褪黑素(Melatonin, MLT)（图2E）。值得注意的是，褪黑素(Melatonin, MLT)和 3-羟基****(3-Hydroxyanthranilic acid, 3-HAA)水平与BMD显著正相关（图2F）。其中与3-HAA相比，MLT与BMD之间有更好的线性关系（图2G，H）。这些结果表明，在OP小鼠中，粪便中MLT水平的降低与骨质量下降有关。

图1.  实验研究程序

图2. 肠道微生物来源的MLT随着OP的进展而降低

 

2. MLT以肠道微生物依赖的方式改善OP的进展

进一步探讨补充MLT是否可以改善OP进展过程中的骨丢失（图3A）。MTL明显减轻OVX小鼠的骨质流失（图3B），Tb.Th显著降低，BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Sp以及TMD显著升高（图3C）。此外，H&E和Masson染色表明，MTL显著增加骨面积、骨体积和密度（图3D、E）。同时，骨髓中TRAP⁺细胞数量明显减少，表明MLT对成骨细胞分化具有抑制作用（图3F、G）。还检测血清骨吸收指标Ⅰ型胶原C端裂解肽(C-telopeptide of type I collagen, CTX-1)的水平，发现MLT处理后显著降低（图3H）。综上所述，这些结果表明MLT在体内具有显著的抗骨质疏松症作用，有效改善OVX引起的骨丢失。

图3. MLT显著改善OVX诱导的骨丢失

 

3. FMT可模拟类似于MLT治疗的抗骨质疏松作用

通过对OVX小鼠进行抗生素(antibiotics，ABX)处理明确MLT对OP的作用是否依赖肠道微生物（图4A）。发现两组小鼠骨相关指数无显著差异（图4B、C）。即MLT对OVX诱导的OP的保护作用与肠道微生物有关。进一步通过OVX+NS或OVX+MLT小鼠进行粪便微生物群移植(Fecal microbiota Transplantation, FMT)到ABX处理的OVX小鼠中（图4D）。与FMT(OVX+NS)相比，FMT(OVX+MLT)中BV/TV、Tb.N水平显著增加，Tb.Sp水平降低（图4E、F）。结果表明，MLT通过依赖肠道微生物改善骨丢失。

图4. MLT以肠道微生物依赖的方式减轻OP的进展

 

4. MLT重塑肠道微生物群的组成和结构

进一步对粪便样本进行16S rDNA基因测序分析，覆盖度和香农指数表明，与对照组相比，MTL处理小鼠肠道微生物的丰富度和多样性更高（图5A），主成分分析(principal coordinate analysis, PCoA)发现两组存在显著差异（图5B）。KEGG结果显示，与OVX+NS组相比，氨基酸代谢、能量代谢、其他氨基酸代谢、生物毒素生物降解和代谢以及核苷酸代谢的能力增加，而癌症、衰老、折叠、排序和降解以及耐药性的能力减少（图5C），以及MLT处理降低有氧和形成生物膜类型，同时增加厌氧、含有可移动元件和潜在病原体的类型（图5D）。门水平中，拟杆菌门(Bacteroidetes)的丰度在MLT处理后增加，但厚壁菌门(Firmicutes)和F/B(Firmicutes/Bacteroidetes)比率无显著差异（图5E-H）。

如图6A-C所示，肠道微生物在属水平上的组成和结构明显不同。其中，uncultured_bacterium_f_Muribaculaceae，Allobaculum和Parasutterella丰度显著升高，Akkermansia显著降低，这可能对OP的进展具有显著影响（图6D-H）。进一步通过线性判别分析效应大小和进化树分析发现，在OVX+MLT小鼠中富集到8种细菌，OVX+NS中富集7种细菌（图6I-J）。Akkermansia与Allobaculum、uncultured_bacterium_f_F082和Escherichia‐Shigella呈负相关，Allobaculum与Escherichia‐Shigella与Coriobacteriaceae_UCG‐002呈正相关，与 Lachnospiraceae_UCG‐006呈负相关（图6K）。以上结果表明，MLT可以重塑肠道微生物并逆转OVX诱导的肠道微生物失调。

图5. MLT减轻OVX诱导的OP小鼠的微生物群失调

图6. MLT重塑肠道微生物群的组成和结构

 

5. MLT可调节OP小鼠肠道微生物群相关的TMAO和SCFA代谢

OVX+MLT显著增加乙酸、异*丁*酸、异戊酸、戊酸、丁*酸和丙*酸的水平，虽然己*酸无差异，但SCFAs总量显著升高（图7A-B）。进一步通过TMAO靶向代谢组学，发现TMAO相关代谢物存在差异，其中三甲*胺(trimethylamine, TMA)和胆碱(choline)显著降低（图7D-E）。为了进一步确定肠道微生物代谢物与OP进展之间关系，通过关联分析7种SCFA相关代谢物与5种骨相关指标发现，异*丁*酸和戊酸与BMD、BV/TV和Tb.N呈正相关，但与Tb.Sp呈负相关（图7C）。胆碱和TMA与BMD、BV/TV和Tb.N呈负相关，而与Tb呈正相关（图7F）。综上所述，MLT可通过增加代谢物SCFA和降低TMAO丰度来改善OP。

图7. MLT改变OP小鼠代谢物TMAO和SCFA

 

6. MLT调节M1/M2巨噬细胞平衡，恢复肠道屏障功能

为了研究MTL是否通过调节M1/M2巨噬细胞平衡来挽救骨丢失，通过胫骨免疫荧光检测发现，与NS组相比，MTL组小鼠的M1型巨噬细胞(CD86⁺F4/80⁺)百分比显著减少，同时，MTL组小鼠的M2型巨噬细胞(CD206⁺F4/80⁺)百分比显著增加，表明M1向M2表型的转变（图8A、B）。通过小鼠炎症阵列中发现，OVX+MLT组中促炎细胞因子IL-12(p70)、TNF-α、CXCL1和IL-13明显减少（图8C、D）。此外，MLT显著增加紧密连接蛋白(Occludin、ZO-1)的表达（图8E、F）。总之，MLT显著下调M1/M2比值，降低促炎细胞因子的水平修复肠屏障功能，这可能与SCFA水平的增加和TMAO水平的降低有关。

图8. MLT调节M1/M2巨噬细胞平衡，恢复肠道屏障功能

讨论

研究结果表明，MLT治疗可以通过重塑肠道微生物组合和结构以及代谢物（包括SCFAs和TMAO）来缓解OVX介导的骨丢失，其潜在机制可能与M1/M2平衡和改善肠道屏障功能有关。这些发现为MLT作为OP治疗的新候选药物提供了见解，并为肠道微生物群作为OP进展的关键靶点提供了证据。